青海發光桿菌培養基及培養條件

1.1 材料
菌種：青海發光桿菌為本實驗室篩選，于-20 ℃保存。
發酵培養基：YPD培養基，成分為葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，加水至1 L，pH值7.0，115 ℃滅菌20 min。
1.2 方法
1.2.1 菌種活化
將保存的菌種轉接到種子培養基，37 ℃培養24 h,備用。
1.2.2 種子液的制備
從斜面上挑取一環培養物接種到裝有20 ml 培養液的50 ml 三角瓶中，于30 ℃、220 r/min條件下震蕩培養24 h，備用。
1.2.3 發酵培養
將上述種子培養液按1%的接種量接種于發酵培養基，裝液量100 ml，于30 ℃、220 r/min條件下搖瓶培養48 h。
1.2.4 培養基的單因素試驗
首先通過PB試驗確定影響芽孢得率的顯著培養基成分，再通過對顯著成分的單因素試驗，確定其*添加量。
1.2.5 培養條件的優化
在獲得*培養基的基礎上，對接種量以及發酵模式（震蕩、靜置）進行逐一優化。
1.2.6 計數方法
青海發光桿菌的活菌總數采用稀釋平板計數法；芽孢計數則采用把培養后菌液于80 ℃水浴15 min后稀釋涂平板計數。
結果與分析
2.1 不同培養原料對液體發酵產芽孢能力的影響
在試驗過程中發現青海發光桿菌在若干培養基平板上有產芽孢的能力，其中以加入淀粉的平板產芽孢zui早，在24 h產生，以加入蛋白胨的平板為zui高，因此，綜合考慮，我們選擇幾種工業上發酵罐中常用的碳氮源作為PB實驗的篩選因子。
試驗模型的R2值為0.91，表明實驗有91%的數據能夠用此模型擬合，模型情況較好。Shapiro-Wilktest表明數據符合正態分布。同時各因素的作用顯著性排序為：蛋白胨>淀粉>大豆粉>葡萄糖>酵母膏>K2HPO4>(NH4)2SO4。其中顯著的因素為蛋白胨、大豆粉和淀粉。
2.2青海發光桿菌形成培養基的確定
根據2.1 節所獲得的結果，我們選擇了蛋白胨、淀粉和大豆粉等3個因素為考察對象，其余因素取低水平。對此3因素進行單因素實驗，摸索它們的*添加量。
淀粉*的添加量為0.2%、蛋白胨*添加量為0.5%、大豆粉*添加量為1.0%，結合2.1節的結果，確定青海發光桿菌發酵產芽孢的*培養基為淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO40.02%。
2.3 接種量的單因素實驗
在確定發酵培養基的基礎上，進一步研究了初始種子接種量對發酵后芽孢數的影響。
隨著初始種子接種量的增加，發酵后的芽孢數量也逐步提高，考慮到實際，合理的接種量應該控制在3%~5%。
2.4 不同的培養方式對青海發光桿菌得率的影響
研究表明，提高通氣量有助于青海發光桿菌轉變為芽孢，而靜置培養又可提高初始菌數。因此我們選取了3種不同的作用方式。*的培養方式為連續搖瓶的方式，在此條件下，芽孢數量可以達到3.5×108 cfu/ml。